ROTOR自動(dòng)化技術(shù)——快速構建高通量酵母文庫

釀酒酵母突變文庫是系統生物學(xué)研究的理想模型。因此酵母菌文庫有非常重要的意義，但由于其含有標記標簽和調和因子的比較罕見(jiàn)，要構建是非常昂貴和費力的。

—Nat Methods. 2016 Apr; 13(4): 371–378.

事實(shí)證明，系統性文庫對酵母菌內的全基因組研究有重大的意義—實(shí)例包括酵母基因敲除文庫和酵母GFP文庫。每個(gè)文庫都能讓人們對酵母生物學(xué)的各個(gè)方面進(jìn)行全新的認識，然而，建立酵母文庫需要付出巨大的努力，這常常掩蓋了酵母文庫本身的價(jià)值。無(wú)休止的轉化、挑取、克隆和驗證工作，成本巨大，工作流程冗長(cháng)，使科學(xué)家對解決其他新的生物學(xué)問(wèn)題望而卻步。
 

海德堡大學(xué)Michael Knop實(shí)驗室的Anton Khmelinskii和Matthias Meurer開(kāi)發(fā)了一種無(wú)縫基因標記方法，以減輕文庫構建過(guò)程中面臨的問(wèn)題。他們與以色列魏茨曼科學(xué)研究院的Maya Schuldiner實(shí)驗室的IdoYofe和Uri Weill一起，將這種方法進(jìn)一步發(fā)展為SWAp-Tag法。利用ROTOR，此方法可以在短短三周內快速構建文庫。

文章來(lái)源：(2016) One Library to make them all: Streamlining yeast library creation by a SWAp-Tag (SWAT) strategy. Nature methods 13: 371-378

作者：Yofe, I., Weill, U., Meurer, M., Chuartzman, S., Zalckvar. E., Goldman, O., Ben-Dor, S., Schütze, C., Wiedermann, N., Knop, M., Khmelinskii, A. and Schuldiner, M.

SWAp-Tag (SWAT)技術(shù)

SWAp-Tag（SWAT）法依賴(lài)于初始受體庫的生成。該受體庫充當模板，可以以“即插即用”的方式交換到其他文庫中。

該文庫的構建方法很有特色，因為它需要一個(gè)一次性傳統方法構建的受體菌株文庫，受體模塊插入到已知的基因組位置。通過(guò)將受體文庫與含有表達所需要模塊的供體株配對，可以用新的標記、啟動(dòng)子或其他所需的基因組序列替換該受體模塊。這樣可以輕松，準確且經(jīng)濟高效地創(chuàng )建無(wú)數個(gè)新的文庫。

SWAT法可以快速直接地生成系統文庫：

（a）整合SWAT受體模塊在N'末端標記蛋白質(zhì)。

（b）利用ROTOR讓受體菌株與供體菌株雜交來(lái)生成新文庫。再用ROTOR來(lái)選擇單倍體孢子并誘導I-SceI表達。

（c）潛在的供體質(zhì)粒（頂部），可用于創(chuàng )建基因標記文庫（底部）
 

SWAT技術(shù)的特點(diǎn)：快速、靈活、免費

Schuldiner和Knop實(shí)驗室創(chuàng )建了一種創(chuàng )新的、極其快速的文庫構建方法，它可以通過(guò)合成不同模塊，輕松生成文庫，而不是從頭開(kāi)始為每個(gè)模塊創(chuàng )建新的文庫。在獲得或構建一個(gè)受體文庫后，一個(gè)新的文庫可以在短短三周內生成，并可以立即用于全基因組研究。Schuldiner實(shí)驗室已經(jīng)創(chuàng )建了一個(gè)原始的受體N' -SWAT文庫，該文庫的N端標記為組成性表達的GFP。此外，此外，使用SWAT法從原始受體庫中又獲得了另外兩個(gè)文庫：N’mCherry-tag庫和N’ GFP庫?，F在可以從Maya Schuldiner教授已發(fā)表的SWAT文庫中免費獲得GFP-tag、mCherry-tag或GFP熒光文庫。

這種方法的瓶頸是雜交和篩選的步驟。Schuldiner和Knop實(shí)驗室使用Singer Instruments公司的ROTOR來(lái)突破這些瓶頸。因此，用ROTOR處理菌株，雜交、產(chǎn)孢，標簽交換篩選/計數篩選、被用來(lái)處理所有的應變，交配和產(chǎn)孢程序，標簽交換選擇/反選擇，以及在文庫中篩選成功的集成模塊。

這一迅速的過(guò)程意味著(zhù)科學(xué)家可以在他們靈活地創(chuàng )建和可視化從未見(jiàn)過(guò)的蛋白質(zhì)。標簽介導的定位問(wèn)題已通過(guò)SWAp-TAG方法解決，因為它使ORFs可以在5'或3'末端進(jìn)行標記，大幅地減少錯位或蛋白質(zhì)不穩定的影響。
 

“Creation of new libraries would not have been possible without our Singer ROTOR robot”.

——Prof. Maya Schuldiner – 2017

SWAT技術(shù)的應用和意義

從理論上講，任何標簽都可用于從N’-SWAT受體庫中構建新的文庫。該標簽可以用于共定位研究的不同顏色熒光，也可以是用于測量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的互補標簽。一旦生成了C’-SWAT受體文庫，無(wú)論是定量轉錄和翻譯效果的啟動(dòng)子、UTR還是其他非編碼DNA，基因5’或3’末端的任何部分都可以被修改。半衰期可以用定時(shí)熒光來(lái)研究，或用下拉標簽來(lái)分離蛋白質(zhì)。

SWAT法生成文庫，節省了很多寶貴的時(shí)間，使研究人員可以設計更多有意義的實(shí)驗，這也為系統探索細胞生物學(xué)的未知領(lǐng)域打開(kāi)了一扇大門(mén)。Schuldiner實(shí)驗室已經(jīng)將N'SWAT文庫用于共定位篩選、過(guò)表達篩選以及體內觀(guān)察相互作用。正如Schuldiner教授所說(shuō)：“樂(lè )趣無(wú)窮！”。

ROTOR

合適的工具是實(shí)驗成功的關(guān)鍵